所需的蛋白質純度取決於蛋白質預期的最終用途。
對於某些應用，粗提取物就足夠了。 但是，對於其他用途，例如在食品和藥品中，則需要高純度。 為了實現這一點，通常使用幾種蛋白質純化方法，在一系列純化步驟中。
每個蛋白質純化步驟通常導致一定程度的產物損失。 因此，理想的蛋白質純化策略是在最少的步驟中達到最高純化水平的策略。 選擇使用哪些步驟取決於靶蛋白的大小，電荷，溶解度和其他性質。 以下技術最適合純化單個胞質蛋白。 胞質蛋白複合物的純化更複雜，通常需要應用不同的方法。
蛋白質純化的第一步
純化細胞內 （細胞內）蛋白質的第一步是製備粗提取物 。
提取物將含有來自細胞質的所有蛋白質的複雜混合物，以及一些額外的大分子，輔因子和營養素。 粗提取物可用於生物技術的一些應用，然而，如果純度是個問題，則必須遵循隨後的純化步驟。
通過去除細胞裂解產生的細胞碎片來製備粗蛋白質提取物，細胞裂解使用化學品和酶 ，超聲處理或French Press實現。 通過離心去除碎片，並回收上清液。 細胞外蛋白質的粗製品可以通過簡單地通過離心除去細胞來獲得。
對於某些生物技術應用，需要熱穩定酶 ：可以耐受高溫而不變性，同時保持高比活性的酶。 生產它們的有機體有時被稱為極端微生物。 純化耐熱蛋白質的一種簡單方法是通過加熱使混合物中的其他蛋白質變性，然後冷卻溶液（如果需要，使熱穩定酶重新形成或重新溶解）。然後可以通過離心除去變性的蛋白質。
中間純化步驟
過去，從粗提物中純化蛋白質的常見第二步是通過在具有高滲透強度的溶液（即鹽溶液）中沉澱 。 粗提取物中的核酸可以通過沉澱由硫酸鏈黴素或硫酸魚精蛋白形成的聚集物來除去。
蛋白質沉澱通常使用硫酸銨作為鹽來完成。
不同的蛋白質會在不同濃度的硫酸銨中沉澱 。 通常，較高分子量的蛋白質在較低濃度的硫酸銨中沉澱。 鹽沉澱通常不會導致高度純化的蛋白質，但可以幫助消除混合物中的一些不需要的蛋白質並濃縮樣品。 然後通過多孔纖維素管透析，過濾或凝膠排阻色譜法除去溶液中的鹽。
現代生物技術協議通常利用許多商用套件，為標準程序提供現成的解決方案。 通常使用過濾器和製備的凝膠過濾柱進行蛋白質純化。 您只需按照說明進行操作，並添加適量的正確溶液，並在收集新鮮試管中的洗脫液（柱的另一端）時等待指定的時間。
- 色譜方法可以使用台式色譜柱或自動HPLC設備進行應用。 通過HPLC分離可以通過反相，離子交換或尺寸排阻方法進行分離，並通過二極管陣列或激光技術檢測樣品。
蛋白質可視化和純化評估
- 反相色譜 （RPC）根據其相對疏水性分離蛋白質。 該技術具有很高的選擇性，但需要使用有機溶劑。 一些蛋白質被溶劑永久變性，在RPC期間會失去功能。 因此不建議將這種方法用於所有應用，特別是如果目標蛋白質有必要保持活性。
- 離子交換色譜是指基於電荷的蛋白質分離。 色譜柱可以用於陰離子交換或陽離子交換。 陰離子交換柱包含帶正電荷的固定相，吸引帶負電荷的蛋白質。 陽離子交換柱是反向的帶負電荷的珠子，它吸引帶正電荷的蛋白質。 通過改變柱中的pH來完成靶蛋白的洗脫，這導致每種蛋白質的帶電官能團的改變或中和。
- 尺寸排阻色譜（ 凝膠過濾 ）將較大的蛋白與小的蛋白分離，因為較大的分子通過色譜柱中的交聯聚合物更快地移動。 大蛋白質不適合聚合物的孔隙，而較小的蛋白質則適用，並且需要更長的時間才能穿過色譜柱，通過它們較不直接的路線。 根據洗脫時間將洗脫物收集在一系列分離蛋白質的管中。 凝膠過濾是濃縮蛋白質樣品的有用工具，因為目標蛋白質的收集量要比最初加入色譜柱的洗脫體積小。 由於其成本效益，在大規模蛋白質生產過程中可能會使用類似的過濾技術。
- 親和色譜法是“拋光”或完成蛋白質純化過程的非常有用的技術。 色譜柱中的珠子與特異性結合靶蛋白的配體交聯。 然後通過用含有游離配體的溶液漂洗將蛋白質從柱中除去。 與其他技術相比，此方法提供最純粹的結果和最高的比活性。
- SDS-PAGE是聚丙烯酰胺凝膠電泳，在SDS（十二烷基硫酸鈉）存在下進行，所述SDS（十二烷基硫酸鈉）與蛋白質結合，給它們帶來大的淨負電荷。 由於所有蛋白質的電荷都相當相等，這種方法幾乎完全基於大小將它們分開。 在一系列的每一步後，SDS-PAGE通常用於檢測蛋白質的純度。 隨著不需要的蛋白質逐漸從混合物中除去，SDS-PAGE凝膠上可見的條帶數量減少，直到僅有一條代表所需蛋白質的條帶。
- 免疫印跡是與親和層析結合使用的蛋白質可視化技術。 用於特定蛋白質的抗體在親和層析柱上用作配體。 目標蛋白質保留在柱上，然後通過用鹽溶液或其他試劑沖洗柱來除去。 與放射性標記或染料標記相連的抗體一旦從混合物的其餘部分分離就有助於檢測靶蛋白。
資料來源：
Zubay G.1988.Biochemistry，2nd Edition。 Macmillan Publishing Co.，New York，NY，USA。
Amersham Pharmacia Biotech。 蛋白質純化手冊，版本AB。 Amersham Pharmacia Biotech Inc.美國新澤西州。 http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf。