對聚合酶鍊式反應（PCR）反應中任何組分的調整可以改變結果的質量，或者通過改進或者減少產物產量和質量，或者通過改進反應特異性和靈敏度來改變。 影響最終結果的參數可以是物理的（即溫度，循環時間）或化學的（即模板濃度，使用的酶的類型）。 以下是影響PCR成功的幾個關鍵因素。
01清潔實驗室條件
由於PCR能夠檢測到單個DNA分子，因此在實驗室保持原始狀態很重要。 始終佩戴新鮮手套，使用無菌玻璃器皿，管子和移液器吸頭以及無菌溶液，並在開始工作前清潔工作區域。
始終包括沒有模板DNA和無酶的對照反應，以確保結果真正歸因於正確樣品的擴增。
大多數人確保有自己的解決方案，不共享，使故障排除更容易，指定的移液器通常僅用於PCR。 脫氧核糖核酸酶和無RNA酶的PCR管，防氣溶膠吸頭和在帶紫外燈的通風櫥中工作也是最大限度減少問題的方法。
02化學成分
- 有18至24個基地
- 沒有二級結構（即髮夾環）
- G / C和A / T對均衡分配
- 在3英尺的兩端不能互補
- 熔化溫度（Tm）在退火溫度以下約5-10攝氏度，通常在55和65攝氏度之間
兩種引物的Tm也應該相似以獲得最佳結果。
03反應混合物：模板和引物
最佳引物濃度在0.1和0.6微摩爾/ L之間。 模板量取決於DNA的類型（人類，細菌，質粒）。
由於模板數量非常少，因此還有其他策略可以改善結果，如增加週期數或使用“熱啟動”。 總是用陽性對照反應測試新引物，確保它們在特定的實驗條件下工作。
04反應混合物：酶活性
反應混合物中MgCl 2的濃度可影響PCR結果，並可在更苛刻的反應中起重要作用。 鎂陽離子與dNTP形成可溶性複合物以產生聚合酶識別的實際底物。
等量的全部四種dNTP也有助於降低聚合酶錯誤率。 某些添加劑如甜菜鹼，BSA，去垢劑，DMSO，甘油和焦磷酸酶也會影響酶的特異性或反應效率。
05型熱循環儀
購買實驗室設備時，請記住，某些熱循環儀在維持精確的所需溫度時比其他熱循環儀精確度低。
當您面臨挑剔的反應或使用需要窄範圍退火溫度的引物時，從長遠來看，這是一個便宜的產品。
設計用於符合您使用的熱循環儀的精確品牌的薄壁反應管，也有助於優化反應溫度。
06週期設置
通過增加大約每20個循環的延伸時間可以獲得增加的產量，以補償較少的酶以擴增更多的模板。 通常，少於40個循環就足以將少於10個模板分子放大到足以在溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠上觀察的濃度。