基因克隆是製造單個基因拷貝或克隆的行為。 一旦確定了一個基因,克隆就可以用於生物醫學和工業研究的許多領域。 基因工程是將基因克隆到新生物體中或改變DNA序列以改變蛋白質產物的過程。 基因工程取決於我們執行以下基本程序的能力。
01 聚合酶鍊式反應
02 限制酶
被稱為限制性內切酶的酶的發現對於蛋白質工程學是必不可少的。 這些酶根據核苷酸序列在特定位置切割DNA。 已經從許多不同的細菌菌株中分離出數百種不同的限制酶 ,能夠在不同的位點切割DNA。 用限制酶切割的DNA產生許多不同大小的較小片段。 這些可以使用凝膠電泳或色譜分離。
03電泳
從細胞培養物中純化DNA,或使用限制性內切酶切割DNA,如果我們無法想像DNA,那麼這種方法就沒有多大用處 - 也就是說,找到一種方法來查看您的提取物是否含有任何物質,或者是什麼尺寸的碎片已切入。 一種做法是通過凝膠電泳。 凝膠被用於各種目的,從查看切割DNA到檢測DNA插入和敲除。
04加入兩片DNA
在基因研究中,通常需要連接兩個或更多個DNA鏈,創建重組鏈,或者關閉已用限制性內切酶切割的環狀鏈。 稱為DNA連接酶的酶可以在核苷酸鏈之間產生共價鍵。 酶DNA聚合酶I和多核苷酸激酶在該過程中也是重要的,分別用於填充空位或磷酸化5'末端。
05小型自我複制DNA的選擇
不屬於細菌基因組但是能夠自我複制的小圓形DNA被稱為質粒。 質粒通常用作載體在微生物之間轉運基因。 在生物技術中,一旦感興趣的基因被擴增並且基因和質粒都被限制酶切割,它們被連接在一起產生所謂的重組DNA。 病毒(噬菌體)DNA也可用作載體,粘粒也可用作含噬菌體基因的重組質粒。
06將矢量移動到主機單元的方法
將載體如質粒上的遺傳物質轉移到新的宿主細胞中的過程稱為轉化。 這種技術要求宿主細胞暴露於環境變化中,這使得它們對於載體“有能力”或暫時可滲透。 電穿孔就是這樣一種技術。 質粒越大,其被細胞攝取的效率越低。 在稱為轉導的方法中,使用噬菌體,逆轉錄病毒或其他病毒載體或粘粒更容易地克隆更大的DNA片段。 噬菌體或病毒載體通常用於再生醫學,但可能會導致DNA插入我們不想要的部分染色體,導致並發症甚至癌症。
07選擇轉基因生物的方法
並非所有細胞在轉化過程中都會吸收DNA。 有必要有一種方法來檢測那些做的。 通常,質粒攜帶抗生素抗性基因,並且可以基於這些基因的表達和它們在含有該抗生素的培養基上生長的能力來選擇轉基因細胞。 備選的選擇方法取決於其他報導蛋白如x-gal / lacZ系統或綠色熒光蛋白的存在,它們分別允許基於顏色和熒光的選擇。