DNA測序還取決於我們使用凝膠電泳來分離大小差異僅為一個鹼基對的DNA鏈的能力。
DNA測序
在二十世紀七十年代後期，發明了兩種更長DNA分子的DNA測序技術。 這些是Sanger （或雙脫氧）法和Maxam-Gilbert （化學切割）法。 Maxam-Gilbert方法基於化學物質的核苷酸特異性切割，最適用於測序寡核苷酸（短核苷酸聚合物，通常長度小於50個鹼基對）。 Sanger方法更常用，因為它在技術上已經被證明更易於應用，並且隨著PCR和自動化技術的出現，可以很容易地應用於包括一些完整基因的DNA長鏈。 該技術基於PCR延長反應期間雙脫氧核苷酸的鏈終止。
桑格方法
在Sanger方法中，將要分析的DNA鏈用作模板，在PCR反應中使用DNA聚合酶以使用引物產生互補鏈。
製備四種不同的PCR反應混合物，每種都含有一定比例的與四種核苷酸之一（ATP，CTP，GTP或TTP）的雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）類似物。 新DNA鏈的合成一直持續到這些類似物中的一種被併入，此時該鏈過早被截短。
每個PCR反應將最終含有不同長度的DNA鏈的混合物，所有DNA都以用於該反應的雙脫氧核苷酸標記的核苷酸結束。 然後使用凝膠電泳在四個獨立的泳道中分離四個反應的鏈，並且基於什麼長度的鏈以什麼核苷酸結束來確定原始模板的序列。
在自動Sanger反應中，使用了用四種不同顏色的熒光標籤標記的引物。 如上所述進行在不同雙脫氧核苷酸存在下的PCR反應。 但是，接下來，將四種反應混合物合併並施加到單一泳道的凝膠上。 使用激光束檢測每個片段的顏色，並且由計算機收集信息，該計算機生成顯示每種顏色的峰的色譜圖，從中可以確定模板DNA序列。
通常，自動測序方法僅對長度最多約700-800個鹼基對的序列是準確的。 然而，有可能使用逐步法（例如Primer Walking和Shotgun測序）獲得更大基因的全序列，實際上可以獲得全基因組。
在Primer Walking中 ，使用Sanger方法對較大基因的可行部分進行測序。 從序列的可靠區段產生新的引物並用於繼續測序超出原始反應範圍的基因部分。
鳥槍法測序需要將感興趣的DNA片段隨機切割成更合適的（可管理的）大小的片段，對每個片段進行測序，並基於重疊的序列對片段進行排列。 通過應用計算機軟件來安排重疊部分，這種技術變得更加容易。